วิธีการแก้ไขการเคลื่อนที่แบบใหม่สำหรับกล้องจุลทรรศน์โลคัลไลเซชันแบบโมเลกุลเดี่ยว (SMLM) ช่วยให้นักวิจัยสามารถวัดตำแหน่งของโมเลกุลแต่ละตัวได้อย่างแม่นยำเป็นประวัติการณ์ ทีมงานของ มหาวิทยาลัยนิวเซาธ์เวลส์ (UNSW) ได้กำหนดระยะห่างระหว่างโปรตีนแต่ละชนิดบนผิวเซลล์ภูมิคุ้มกันของมนุษย์ด้วยความแม่นยำระดับนาโนเมตรด้วยการทำให้ภาพ SMLM เสถียรในแบบเรียลไทม์
การปรับปรุงความละเอียด SMLM นี้อาจนำไปสู่
ความเข้าใจในการส่งสัญญาณของเซลล์มากขึ้น แต่เทคนิคนี้อาจนำไปใช้กับเครื่องมือที่มีความแม่นยำสูงอื่นๆ เช่น ซีเควนเซอร์ดีเอ็นเอและกล้องจุลทรรศน์แรงอะตอม การสังเกตกระบวนการของเซลล์ในระดับโมเลกุลแต่ละโมเลกุลต้องการภาพที่มีความละเอียดที่ไม่สามารถทำได้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบธรรมดา: ที่ความยาวคลื่นแสง ความละเอียดที่ดีที่สุดที่อนุญาตโดยขีดจำกัดการเลี้ยวเบนนั้นหยาบเกินไป อย่างไรก็ตาม ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา นักวิจัยได้ค้นพบวิธีที่จะก้าวข้ามขีดจำกัดนี้โดยใช้เทคนิคที่รู้จักกันในชื่อ SMLM
ใน SMLM โมเลกุลเป้าหมายจะติดฉลากด้วยเครื่องหมายเรืองแสงที่ปล่อยออกมาในช่วงเวลาสั้นๆ ในช่วงเวลาสุ่ม ภาพที่ถ่ายในช่วงเวลาใดเวลาหนึ่งอาจบันทึกเหตุการณ์กระตุ้นแต่ละเหตุการณ์เพียงสองสามเหตุการณ์ แต่ด้วยการซ้อนเฟรมหลายพันเฟรมที่ได้มาในช่วงเวลาหลายชั่วโมงหรือหลายวัน สามารถสร้างแผนที่โมเลกุลที่ครอบคลุมได้ ตราบใดที่เหตุการณ์การแผ่รังสีในแต่ละเฟรมแยกจากกัน สัญญาณที่สะสมสามารถถูกปรับให้พอดีทางสถิติเพื่อค้นหาแหล่งกำเนิดของแต่ละโมเลกุลไปยังนาโนเมตรที่ใกล้ที่สุด
อย่างน้อยนั่นคือวิธีการทำงานภายใต้สภาวะที่เหมาะสม
ในความเป็นจริง การเคลื่อนไหวเพียงเล็กน้อยของกล้องตลอดกระบวนการหมายความว่า จนถึงขณะนี้ นักวิจัยได้พยายามดิ้นรนเพื่อตรึงตำแหน่งของโมเลกุลด้วยความแม่นยำที่ดีกว่า 20-30 นาโนเมตร
“มีหลายสิ่งที่ทำให้เครื่องดนตรีลอย” Katharina Gaus หัวหน้าทีม กล่าว “สาเหตุที่ใหญ่ที่สุดน่าจะเป็นแรงสั่นสะเทือน เช่น จากคนที่เดินอยู่ในห้องและทางเดินที่อยู่ติดกัน เป็นต้น อาคารทุกหลังยังมีความถี่ตามธรรมชาติและสั่นเมื่อรถ (หรือในกรณีของเราคือรถราง) แล่นผ่านด้านนอก”
นักวิจัยจากมหาวิทยาลัยนิวเซาท์เวลส์Gaus และเพื่อนร่วมงานของเธอได้พัฒนาวิธีชดเชยการเคลื่อนไหวนี้โดยใช้เทคนิคสามแบบแยกกัน ขั้นแรก พวกเขาวางเม็ดบีดโพลีสไตรีนขนาด 3 µm ไว้บนสเตจการถ่ายภาพ (นอกระยะการมองเห็นของกล้อง) เป็นมาร์กเกอร์ที่เชื่อถือได้ เมื่อส่องสว่างด้วยเลเซอร์อินฟราเรด เม็ดบีดจะสร้างวงแหวนเลี้ยวเบนซึ่งเผยให้เห็นการเคลื่อนไหวสัมพัทธ์ใดๆ ระหว่างตัวอย่างกับส่วนที่เหลือของเครื่องมือ การวัดเหล่านี้ถูกส่งผ่านไปยังลูปป้อนกลับซึ่งแก้ไขตำแหน่งของตัวอย่าง 12 ครั้งต่อวินาที โดยจำกัดการเคลื่อนที่ให้เหลือน้อยกว่า 1 นาโนเมตรในระยะเวลา 20 ชั่วโมง
ทีมงานได้ตั้งค่าฟีดแบ็คลูปใหม่โดยการรวมไฟ LED สีขาวเข้ากับตัวกล้องจุลทรรศน์และโฟกัสไปที่มุมของเซนเซอร์ของกล้อง ซึ่งเป็นอุปกรณ์ชาร์จควบคู่ (EMCCD) ที่คูณด้วยอิเล็กตรอน สิ่งนี้ทำให้เกิดออปติคัล fiducial ซึ่งสามารถระบุจุดสูงสุดของความเข้มได้ด้วยความแม่นยำ 0.05 นาโนเมตร การเปลี่ยนแปลงในตำแหน่งนี้แสดงถึงการล่องลอยในสัญญาณเรืองแสง ซึ่งนักวิจัยแก้ไขโดยอัตโนมัติด้วยกระจกเพียโซอิเล็กทริก
การแก้ไขครั้งที่สามระบุถึงความคลาดเคลื่อนที่
อาจเกิดขึ้นในการที่ EMCCD ของกล้องบันทึกตำแหน่งของตัวปล่อยสีเขียวหรือสีแดง เพื่อตรวจจับและชดเชยความคลาดเคลื่อนดังกล่าว นักวิจัยได้วัดการตอบสนองของเซ็นเซอร์ต่ออาร์เรย์นาโนโฮลที่เต็มไปด้วยสีเขียวและสีแดง
Gaus และเพื่อนร่วมงานได้ทดสอบเทคนิคของพวกเขาซึ่งเรียกว่า Feedback SMLM โดยการวัดตำแหน่งของโปรตีนส่งสัญญาณบนเซลล์ T ของมนุษย์ พวกเขาพบว่ากระบวนการกระตุ้นทีเซลล์ถูกกำหนดโดยระยะห่างระหว่างโปรตีนจำเพาะ และความแตกต่างในการแยกเพียง 4-7 นาโนเมตรทำให้การตอบสนองของเซลล์แตกต่างไปจากที่อื่น
แม้ว่าการแยกแยะระยะทางเล็กๆ ดังกล่าวจะเป็นไปไม่ได้โดยใช้ SMLM แบบเดิม แต่ก็อยู่ในขอบเขตของวิธีการที่มีอยู่ซึ่งเรียกว่าการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสง (FRET) ในเทคนิคนี้ ความใกล้เคียงที่แตกต่างกันของฟลูออโรฟอร์สองชนิดจะสะท้อนให้เห็นในการเปลี่ยนแปลงความเข้มของการปล่อยก๊าซ อย่างไรก็ตาม Gaus คิดว่า Feedback SMLM สามารถแทนที่ FRET ได้ เนื่องจากเทคนิคหลังนี้ทำให้มองไม่เห็นระยะห่างระหว่างโมเลกุลที่มากกว่า 10 นาโนเมตร และยังได้รับผลกระทบจากปัจจัยอื่นๆ เช่น การจัดตำแหน่งไดโพลของฟลูออโรฟอร์และค่า pH ของสิ่งแวดล้อมด้วย
Masaki Horiซึ่งอยู่ที่ MPQ และเพื่อนร่วมงานได้เอาชนะอุปสรรคนี้ด้วยการสร้างอะตอมของ pionic helium ที่มีอายุยืนยาว ในการทดลองที่สถาบัน Paul Scherrerในสวิตเซอร์แลนด์ พวกเขาใช้ลำแสงโปรตอนที่รุนแรงเพื่อสร้างไพออนเชิงลบในเป้าหมายของคาร์บอน จากนั้นชนกับไพออนกับอะตอมของซุปเปอร์ฟลูอิดฮีเลียม-4
ไพออนที่เข้ามาส่วนใหญ่จะกระแทกกับนิวเคลียสของฮีเลียมโดยตรง ทำให้ฮีเลียมแยกออกเป็นโปรตอน นิวตรอน และดิวเทอรอนภายในช่วงพิโควินาที (10 -12วินาที) แต่ประมาณ 2% จัดการเพื่อแทนที่หนึ่งในสองอิเล็กตรอนของฮีเลียมและเข้าสู่วงโคจรที่มีพันธะน้อยรอบนิวเคลียส ไพออนที่ถูกผูกมัดจะคงวงโคจรนี้ไว้หลายนาโนวินาที (10 –9วินาที) เนื่องจากพวกมันได้รับการปกป้องจากผลกระทบของการชนกันของความร้อนกับอะตอมอื่น ๆ โดยทั้งอิเล็กตรอนที่เหลือและเป้าหมายที่เย็นมาก ซึ่งอยู่เหนือระดับเพียงสองสามองศา ศูนย์สัมบูรณ์
ทิ้งให้อุปกรณ์ของตัวเอง อะตอมฮีเลียม pionic จะแยกและสร้างผลิตภัณฑ์ฟิชชันที่เครื่องตรวจจับตำแหน่งรอบเป้าหมายสามารถหยิบขึ้นมาได้ ปัญหาคือสัญญาณจากผลิตภัณฑ์ฟิชชันเหล่านี้ท่วมท้นโดยสัญญาณจากนิวคลีออนที่สร้างขึ้นโดย 98% ของไพออนที่เข้ามา ไพออนจะมาถึงเป็นพัลส์ทุกๆ 20 ns ด้วยความถี่ 50 MHz ของช่องคันเร่ง และพวกมันสร้างยอดใหญ่ในจำนวนเครื่องตรวจจับ ในทางตรงกันข้าม การสลายโดยธรรมชาติของอะตอม pionic ที่ลุกลามได้จะสร้างพื้นหลังที่ราบเรียบที่ไม่สามารถสังเกตได้
Credit : mypercu.net ondrejsury.net ottawahomebuilders.net pandorajewellerybuy.org percepcionsonora.com
